Editoval Peter Sarnow, lékařská fakulta Stanfordské univerzity, Stanfordská univerzita, Kalifornie, schváleno 25. prosince 2020 (revidováno 25. října 2020)
Uvádíme interakci mezi podjednotkami při replikaci koronavirů-transkripčních komplexů, které jsou nezbytné pro replikaci a evoluční konzervaci.Poskytli jsme důkaz, že doména NiRAN spojená s nsp12 má nukleosidmonofosfátovou (NMP) transferázovou aktivitu v trans a identifikovali jsme nsp9 (protein vázající RNA) jako svůj cíl.NiRAN katalyzuje kovalentní připojení NMP skupiny ke konzervovanému nsp9 amino konci v reakci, která se opírá o Mn2+ ionty a sousední konzervované Asn zbytky.Bylo zjištěno, že aktivita NiRAN a nsp9 NMPylace jsou nezbytné pro replikaci koronaviru.Data nám umožňují spojit tuto aktivitu enzymového markeru vnořeného viru s předchozími pozorováními v hypotéze, že zahájení syntézy RNA ve třídě RNA virů je funkčně a evolučně konzistentní.
RNA-dependentní RNA polymeráza (RdRps) z Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae a 12 dalších čeledí) je spojena s amino-terminální (N-terminální) doménou v nestrukturálním proteinu (nsp) uvolněném z polyproteinu, zvaném NiRAN 1ab se skládá z virové hlavní proteázy (Mpro).Dříve byla hlášena vlastní GMPylační/UMPylační aktivita arteriálního viru NiRAN-RdRp nsp a bylo navrženo vytvořit přechodný přechod pro přenos nukleosidmonofosfátu (NMP) do (v současnosti neznámého) viru a/nebo věcí biopolymerizace buněk.Zde ukazujeme, že koronavirus (lidský koronavirus [HCoV]-229E a těžký akutní respirační syndrom Coronavirus 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) má NMPylační aktivitu závislou na Mn2+, která je odvozena z nsp9 prostřednictvím tvorby nsp9 zprostředkovaného Mpro N-koncový lemující nsps je proteolyticky uvolněn, fosforamidát je navázán na primární amin (N3825) na N-konci nsp9.Uridintrifosfát je preferovaný nukleotid v této reakci, ale adenosintrifosfát, guanosintrifosfát a cytidintrifosfát jsou také vhodné ko-substráty.Mutační studie s použitím rekombinantních koronavirových nsp9 a nsp12 proteinů a geneticky upravených HCoV-229E mutantů určily zbytky nezbytné pro NiRAN-zprostředkovanou nsp9 NMPylaci a replikaci viru v buněčné kultuře.Data potvrdila předpověď zbytků aktivního místa NiRAN a určila důležitou roli zbytků nsp9 N3826 v nsp9 NMPylaci a replikaci viru in vitro.Tento zbytek je součástí konzervované N-koncové tripeptidové sekvence NNE a ukázalo se, že je jediným invariantním zbytkem nsp9 a jeho homologů v rodině koronavirů.Tato studie poskytuje pevný základ pro funkční studium NMPylační aktivity jiných vnořených virů a navrhuje možné cíle pro vývoj antivirových léků.
Virus Nidovirales s pozitivním řetězcem RNA infikuje řadu obratlovců a bezobratlých (1, 2).Objednávka v současné době zahrnuje 14 rodin (3), z nichž rodina koronavirů byla v posledních 20 letech rozsáhle studována.V té době se ze zvířecích hostitelů objevily tři zoonotické koronaviry a způsobily rozsáhlá ohniska těžkých respiračních infekcí u lidí.Včetně přetrvávajících pandemií způsobených závažnými akutními infekčními chorobami.Respirační syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7).Nidoviry sdílejí společnou organizaci genomu a podjednotka membránově vázaného replikačně-transkripčního komplexu (RTC) je kódována v 5-?²-terminálních dvou třetinách a hlavní strukturní podjednotce virové částice, stejně jako některé doplňky. .Protein, kódovaný v 3??² koncové třetině genomu (1).Kromě jedné rodiny planárních virů (Monoviridae) (8) všechny vnořené viry kódují RTC podjednotky ve dvou velkých otevřených čtecích rámcích (ORF) ORF1a a ORF1b, které jsou překládány z genomové RNA z.ORF1a kóduje polyprotein (pp) la a ORF1a a ORF1b společně kódují pp1ab.Za obecné účasti hlavní proteázy (Mpro) kódované ORF1a jsou pp1a i pp1ab proteolyticky zpracovány na různé nestrukturální proteiny (nsps), známé také jako 3CLpro, protože mají homologii s 3Cpro pikornaviru ( 9).Předpokládá se, že tyto nsps jsou sestaveny do velkého dynamického RTC, katalyzují syntézu genomové RNA (replikace) a sady subgenomové RNA (transkripce) a používají se ke koordinaci exprese ORF umístěného downstream od ORF1b (10a? 12).
Jádro RTC zahrnuje RNA-dependentní RNA polymerázu (RdRp) (13), helikázu nadrodiny 1 (HEL1) (14, 15) a několik enzymů zpracovávajících RNA, které jsou kódovány hlavně v ORF1b a v rodině koronavirů. Obsahuje nsp12-nsp16 a nsp9-nsp12 z čeledi Arterioviridae (viz odkaz 10ââ 12).RdRp a HEL1 představují dvě (jedna pětina) konzervované domény viru ptačího hnízda a mají homologii mezi ostatními RNA viry.Předpokládá se, že jádrová replikáza je podporována dalšími podjednotkami, včetně několika malých nsp uvolněných z karboxy-terminální (C-terminální) oblasti ppla, downstream od Mpro (koronavirus nsp5 a arteriální virus nsp4, v tomto pořadí).Mají omezenou rodinnou specifickou ochranu a různé aktivity (přezkoumáno v odkazu 10 – 12).
Relativně nedávno byla doména s jedinečnými charakteristikami sekvenčního motivu nalezena na amino konci (N-konec) sousedícím s RdRp u všech vnořených virů, ale žádných jiných RNA virů (16).Na základě své polohy a aktivity nukleotidové transferázy (nukleosidmonofosfát [NMP] transferázy) je tato doména pojmenována NiRAN (nukleotidová transferáza související s Nestvirus RdRp).Dvoudoménová kombinace NiRAN-RdRp tvoří nsp12 v rodině Coronaviridae a nsp9 v rodině Arterioviridae a u dalších nestoviridae se očekává, že NiRAN-RdRp bude uvolňován jako nezávislý nsp z virového polyproteinu.V koronaviru doména NiRAN obsahuje a1/450 zbytků a je připojena k C-koncové doméně RdRp prostřednictvím oblasti linkeru (16-19).U viru koňské arteritidy (EAV) (Arteriviridae) vykazuje rekombinantní nsp9 iontově závislé (vlastní) UMPylační a GMPylační aktivity Mn2+, které závisí na třech konzervovaných sekvenčních bázích v nestoviru, AN, BN a CN zbytcích v sekvenci.Kde N znamená NiRAN) (16).N-terminální lemování těchto motivů je méně konzervativní motiv preAN.Některé z těchto zbytků jsou také konzervovány ve vzdáleně příbuzných proteinkinázách, kde se ukázalo, že se podílejí na vazbě nukleosidtrifosfátu (NTP) a katalytické aktivitě (20, 21).V souladu s tímto pozorováním lze několik klíčových zbytků aktivních míst v pseudokináze SelO z Pseudomonas syringae sestavit s nedávno publikovaným superkomplexem SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13.Konzervované zbytky NiRAN koronaviru superponované v elektronové mikrostruktuře.Rekombinantní protein (17).Spekuluje se, že dokumentovaná (vlastní) U/GMPylace vytvoří přechodný stav k přenosu NMP na (v současnosti neznámý) substrát (16) a strukturální podobnost mezi NiRAN a proteinkinázou (17, 19) je hypotézou, že NiRAN modifikuje jiné proteiny.
Mnoho vlastností, včetně jeho jedinečného a jedinečného systematického spojení s vnořenými viry a genetické separace od RdRp, činí NiRAN rozumným klíčovým regulačním enzymem pro vnořené viry, což je rozhodující pro jejich vznik a identitu.Dříve byly nazývány tři možné funkce zahrnující NiRAN k regulaci genomové/subgenomové translace nebo replikace/transkripce.Když vezmeme v úvahu vzácná a neúplná data dostupná v té době, každá funkce má své výhody a nevýhody (16).V tomto výzkumu se snažíme zkombinovat biochemické a reverzní genetické studie koronavirů reprezentujících dva rody a zasadit naše poznatky do evolučního pozadí přirozené mutace rodiny koronavirů, abychom získali vhled do této tajemné říše.Uvádíme hlavní pokroky v chápání NiRAN prostřednictvím identifikace přirozených cílů v RTC, což (mezi třemi dostupnými hypotézami) přispívá k úloze této domény při zahájení syntézy vnořené virové RNA.Tento výzkum také otevírá možnosti pro další role NiRAN na rozhraní hostitele viru.
Abychom charakterizovali enzymatické vlastnosti domény NiRAN související s koronavirem nsp12, vyrobili jsme rekombinantní formu lidského koronaviru 229E (HCoV-229E) nsp12 v E. coli s His6 tagem na C-konci a zkombinovali protein s [a32-P] Inkubujte společně s NTP v přítomnosti MnCl2, jak je popsáno v části Materiály a metody.Analýza reakčního produktu ukázala přítomnost radioaktivně značeného proteinu migrujícího společně s nsp12 (106 kDa), což ukazuje, že koronavirus nsp12 katalyzuje tvorbu kovalentních aduktů protein-NMP, přednostně tvořených uridinmonofosfátem (UMP) (obrázek 1A) a B).Kvantitativní analýza ukázala, že ve srovnání s jinými nukleotidy se intenzita signálu inkorporace UMP zvýšila 2 až 3krát (obrázek 1C).Tato data jsou v souladu s předpokládanou aktivitou NMP transferázy NiRAN domény koronaviru (16), ale ukazují, že nukleotidové preference NiRAN domény koronaviru a arteriálního viru jsou odlišné.
Samo-NMPylační aktivita HCoV-229E nsp12.(A) HCoV-229E nspl2-His6 (106 kDa) byl inkubován s označeným [a-32P] NTP v přítomnosti 6 mM MnCl2 po dobu 30 minut (podrobnosti viz Materiály a metody).Reakční produkty byly odděleny pomocí SDS-PAGE a obarveny brilantní modří Coomassie.(B) Radioaktivně značený protein je vizualizován fosforovým zobrazením.Polohy nsp12-His6 a markerů molekulové hmotnosti proteinu (v kilodaltonech) jsou uvedeny v A a B. (C) Intenzita radioaktivního signálu (průměr ± SEM) byla stanovena ze tří nezávislých experimentů.*P≤0,05.Síla signálu (v procentech) souvisí s UTP.
Ačkoli se ukázalo, že enzymové aktivity související s NiRAN jsou zásadní pro replikaci EAV a SARS-CoV v buněčné kultuře (16), specifická funkce NiRAN a potenciální cíle nebyly dosud stanoveny.Nedávno hlášená strukturální podobnost mezi NiRAN a rodinou proteinů se záhyby podobnými proteinkináze (17, 22) nás přiměla otestovat hypotézu, že NiRAN katalyzuje NMPylaci jiných proteinů.Vytvořili jsme sadu potenciálních homologních cílů, včetně nestrukturálních proteinů kódovaných HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10), z nichž každý obsahuje C-terminální His6 tag (příloha SI, tabulka S1), a inkubujte tyto proteiny s [a32-P]uridintrifosfátem ([a32-P]UTP) v přítomnosti nebo nepřítomnosti nsp12.Hovězí sérový albumin a fúzní protein MBP-LacZa produkovaný v E. coli sloužily jako kontroly (obrázek 2A, dráhy 1 až 7).Radioaktivně značený protein byl analyzován elektroforézou na polyakrylamidovém gelu s dodecylsulfátem sodným (SDS-PAGE) a autoradiografií a bylo zjištěno, že v reakci obsahující nsp12 a nsp9 byl silný radioaktivní signál.Poloha signálu odpovídá molekulové hmotnosti nsp9, což ukazuje na nsp12-zprostředkovanou UMPylaci nsp9 (obrázek 2B, stopa 7).Nebylo zjištěno, že by byly UMPylovány žádné jiné testované proteiny, což nás vedlo k závěru, že nsp9 je specifický substrát nsp12.V souladu s údaji o vlastní NMPylaci zobrazenými na obrázku 1 je nsp12 schopen přenést všechny čtyři NMP na nsp9, i když účinnost je odlišná, UMP> adenosinmonofosfát (AMP)> guanosinmonofosfát (GMP)> cytidinmonofosfát (CMP)) ( Obrázek).3A a B).Za podmínek použitých v tomto testu (zkrátit dobu reakce a expozice, snížit koncentraci nsp12; materiály a metody) nemohla být detekována vlastní NMPylace nsp12 (srovnej obrázek 2B, dráha 7 a obrázek 1B), která se ukázala jako účinná (a více kol) UMP se přesunula z nsp12 na nsp9.Aktivita UMP transferázy vyžaduje přítomnost Mn2+ iontů, jak je znázorněno na obrázku 3C, zatímco pouze minimální aktivita UMP transferázy byla pozorována v přítomnosti Mg2+ a žádná aktivita v přítomnosti dalších dvou testovaných dvojmocných kationtů.Podobná data byla získána v NMPylačních testech obsahujících cytidintrifosfát (CTP), guanosintrifosfát (GTP) a adenosintrifosfát (ATP) (příloha SI, obrázek S1).
HCoV-229E nsp12-zprostředkovaná UMPylace nsp9.Série proteinových substrátů (včetně hovězího sérového albuminu, MBP-lacZα a série HCoV-229E nsps značených C-koncovým His6 kódovaným ORF1a) byla použita k vyhodnocení UMPylační aktivity HCoV-229E nsp12-His6⁺ zprostředkované protein.Inkubujte protein s [a-32P] UTP po dobu 10 minut v nepřítomnosti (A) nebo přítomnosti (B) nsp12, jak je popsáno v materiálech a metodách.V horní části A a B je zobrazen SDS-polyakrylamidový gel obarvený Coomassie Brilliant Blue a ve spodní části A a B jsou zobrazeny odpovídající autorádiogramy.Pozice markeru molekulové hmotnosti proteinu (v kilodaltonech) je uvedena vlevo.Je také uvedena poloha nsp12-His6 (B, nahoře) a radioaktivní signál pozorovaný během inkubace nsp12-His6 s nsp9-His6 (B, dráha 7), což ukazuje, že [α-32P]UMP na nsp9-His6 (12,9 kDa), což nebylo pozorováno u jiných testovaných proteinů.
HCoV-229E NiRAN-zprostředkovaná biochemická a virologická charakterizace nsp9 NMPylace.(A a B) Role nukleotidového ko-substrátu použitého v reakci.Nsp12-His6 a nsp9-His6 jsou smíchány a inkubovány v přítomnosti různých [a-32P] NTP ve standardním NMPylačním testu.(A, nahoře) Coomassie obarvený nsp9-His6 oddělený SDS-PAGE.(A, dole) Autoradiograf stejné oblasti gelu.(B) Relativní aktivita (průměr ± SEM) v přítomnosti označeného nukleotidového kofaktoru se stanoví ze tří nezávislých experimentů.*P≤0,05.(C) Role kovových iontů.Je ukázán standardní NMPylační test v přítomnosti [a-32P] UTP a různých kovových iontů, každý s koncentrací 1 mM.V horní části C je zobrazen nsp9-His6 obarvený Coomassie a v dolní části C je zobrazena odpovídající autoradiografie.Velikost značeného proteinu (v kilodaltonech) je uvedena vlevo od A a C. (D) Mutovaná forma HCoV-229E nsp12-His6 nesoucí specifikovanou substituci aminokyselin je v [α-32P]UTP, jak je popsáno v materiálech a metodách.Radioaktivně značený nsp9-His6 produkovaný v NMPylační reakci je detekován fosforylačním zobrazením (D, nahoře).Relativní aktivita ve srovnání s proteinem divokého typu (wt) je ukázána v D a spodní část je brána jako průměr (± SEM) ze tří nezávislých experimentů.Hvězdičky označují substituce nekonzervovaných zbytků.(E) Titr viru v supernatantu kultury pl buněk získaných 24 hodin po infekci byl stanoven plakovým testem.Jsou označeny kodonové substituce v doméně NiRAN upravené mutanty HCoV-229E (číslování zbytků je založeno na jejich poloze v pp1ab).Replikačně deficitní mutant RdRp aktivního místa nsp12_DD4823/4AA byl použit jako kontrola.
Abychom získali hlubší pochopení aktivního místa NiRAN a určili zbytky související s aktivitou nsp9-specifické NMP transferázy, provedli jsme mutační analýzu, ve které jsme nahradili konzervativní zbytky v motivech NiRAN AN, BN a CN ( 16) Je to Ala (příloha SI, obrázek S2).Kromě toho byl ve dvou případech hodnocen vliv konzervativních substitucí Arg-to-Lys nebo Lys-to-Arg.Jako (negativní) kontrola jsou zbytky, které nejsou nebo jsou méně konzervované v doméně NiRAN koronavirů a jiných vnořených virů, nahrazeny Ala. Nahrazení K4116A (v motivu preAN), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (motiv BN) a D4280A (CN) významně snižuje nebo dokonce eliminuje nsp9 NMPylaci prostřednictvím nsp12, zatímco proteiny s konzervativními substitucemi (R4178K), K4116R) si zachovávají 60 % a 80 % své aktivity, což naznačuje, že uvolnění omezení na jejich příslušné straně řetězců je fyzikálně-chemicky citlivý (obrázek 3D).Nahrazení několika dalších konzervovaných zbytků E4145A, D4273A, F4281A a D4283A je mnohem méně škodlivé a nsp9 UMPylace je pouze mírně snížena.Podobné výsledky byly získány v nsp9 NMPylačních reakcích zahrnujících jiné NTP (obrázek 3D a příloha SI, obrázek S3), což potvrzuje, že pozorované účinky na specifické substituce aminokyselin jsou nezávislé na typu použitého nukleotidového ko-substrátu.Dále jsme testovali možný dopad těchto nsp12 substitucí na replikaci koronavirů v buněčné kultuře.Za tímto účelem jsme použili vhodné geneticky upravené templáty komplementární DNA (cDNA) klonované v rekombinantním viru vakcínie (23, 24) k transkripci 5-7 buněk.Titrace infekčního virového potomstva produkovaného v těchto buňkách ukázala, že většina HCoV-229E NiRAN mutantů nebyla proveditelná (obrázek 3E).Skupina neživotaschopných virových mutantů zahrnuje alternativy, u kterých bylo prokázáno, že eliminují nebo významně snižují aktivitu NMP transferázy in vitro (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), ale existují dvě další alternativy (K4116R, E4145A) 80 % rezervováno?Jejich in vitro NMPylační aktivita naznačuje, že se jedná o další omezení.Podobně dvě další mutace (R4178K, F4281A), které způsobily mírný pokles in vitro NMPylační aktivity NiRAN, produkovaly živé viry, avšak tyto viry významně snížily titry replikací.V souladu s údaji o aktivitě in vitro ukázanými na obrázku 3D, nahrazující čtyři další zbytky, které nejsou konzervované v koronaviru a/nebo jiných vnořených virech (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) produkovaly životaschopné viry. mírně snížený titr ve srovnání s virem divokého typu (obrázek 3E).
Aby bylo možné studovat, zda aktivita NMP transferázy zprostředkovaná NiRAN závisí na aktivní doméně RdRp, byly dva konzervované zbytky Asp zapojené do koordinace iontů dvojmocných kovů (11) v motivu C RdRp nahrazeny Ala. Výsledný protein nsp12_DD4823/4AA si zachovává jeho nsp9 NMPylační aktivita, což ukazuje, že in vitro nsp9 NMPylační aktivita zprostředkovaná nsp12 nevyžaduje polymerázovou aktivitu (příloha SI, obrázek S4).
Po stanovení nsp9-specifické NMP transferázové aktivity pro nsp12 jsme se pokusili charakterizovat NMP-nsp9 adukt hmotnostní spektrometrií (MS).Kompletní proteinové hmotnostní spektrum rekombinantního HCoV-229E nsp9 ukázalo vrchol při 12 045 Da (obrázek 4A).Přidání nsp12 nezměnilo kvalitu nsp9, což ukazuje, že nsp12 a nsp9 by za použitých podmínek (denaturace) nevytvořily stabilní komplex (obrázek 4A).V přítomnosti UTP a GTP ukázalo hmotnostní měření reakce obsahující nsp9 a nsp12, že proteinová hmotnost UTP se posunula o 306 Da a proteinová hmotnost GTP se posunula o 345 Da, což ukazuje, že každá molekula nsp9 se váže na UMP nebo GMP. (Obrázek 4) C a D).Spekuluje se, že energie potřebná pro nsp9 NMPylaci zprostředkovanou NiRAN pochází z hydrolýzy NTP a uvolňování pyrofosfátu.Ačkoli byl v této reakci použit 10násobný molární nadbytek nsp9 (cíl) než nsp12 (enzym), byla pozorována téměř úplná NMPylace nsp9, což naznačuje, že interakce mezi nsp12 a nsp9 je krátkodobá a nsp12 může NMPylovat více nsp9 in vitro molekula.
Jednoduchá NMPylace nsp9 v přítomnosti nsp12 a UTP nebo GTP.Je ukázáno dekonvoluované kompletní proteinové hmotnostní spektrum HCoV-229E nsp9 (SI příloha, tabulka S1) (AD).(A) samotný nsp9, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 v přítomnosti UTP, (D) nsp9 + nsp12-His6 v přítomnosti GTP.
Pro stanovení nsp9 zbytků UMPylovaných nsp12 byl nsp9-UMP štěpen trypsinem.Výsledné peptidy byly separovány nano-vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) a analyzovány tandemovou hmotnostní spektrometrií (MS/MS) online.Analýza dat pomocí softwarového balíku Byonic (Protein Metrics) ukázala UMPylaci N-koncové aminokyseliny.Toto je potvrzeno ručně.Tandemové hmotnostní spektrum prekurzorového peptidu [UMP]NNEIMPGK (příloha SI, obrázek S5A) odhalilo fragment při 421 m/z, což ukazuje, že UMP se váže na zbytek 1 nsp9.
Na N-konci nsp9 je Asn konzervován mezi členy Orthocoronavirinae (příloha SI, obrázek S6).Ačkoli se domníváme, že N-koncový primární aminový dusík je nejpravděpodobnějším akceptorem pro UMP, rozhodli jsme se získat další důkaz NMP vazby na N-konci.Z tohoto důvodu byl neNMPylovaný a NMPylovaný N-koncový peptid nsp9 purifikovaný pomocí HPLC odvozen v přítomnosti acetonu a kyanoborohydridu sodného.Za těchto podmínek lze propylem (25) modifikovat pouze volné primární aminy.N-koncový peptid odvozený od nsp9 se sekvencí NNEIMPGK obsahuje dva primární aminy, jeden na N-konci Asn a druhý na postranním řetězci Lys na C-konci.Proto mohou být propylové skupiny zavedeny na obou koncích.Extrahované iontové chromatogramy neNMPylovaných peptidů jsou uvedeny v příloze SI, obrázek S5B.Podle očekávání lze identifikovat N-terminální a C-terminální (mono)propylované (SI příloha, obrázek S5B, horní dráha) a dipropylované peptidy (SI příloha, obrázek S5B, spodní dráha).Tento vzorec se mění s použitím NMPylovaného N-koncového peptidu nsp9.V tomto případě lze identifikovat pouze C-terminální propylované peptidy, ale N-terminální propylované peptidy a dipropylované peptidy nejsou identifikovány (příloha SI, obrázek S5C), což ukazuje, že UMP byl přenesen na N-terminální primární amin, aby se tomu zabránilo skupiny od provádění změn.
Dále nahradíme (s Ala nebo Ser) nebo odstraníme konzervované zbytky na N-konci nsp9, abychom definovali cílově specifická omezení.Na základě našich MS dat ukazujících, že NiRAN tvoří nsp9-NMP adukt s primárním aminem N-koncového zbytku nsp9, jsme předpokládali, že nsp9 NMPylace vyžaduje virovou hlavní proteázu (Mpro, nsp5) k uvolnění N-konce nsp9 z jeho polyproteinový prekurzor.Pro testování této hypotézy jsme vytvořili prekurzorový protein nsp7-11 obsahující nsp9 v E. coli a provedli jsme standardní NMPylační test v přítomnosti [α-32P] UTP (materiály a metody).Jak je znázorněno na obrázku 5A (dráha 3), neštěpený prekurzor nsp7-11 není radioaktivně značen pomocí nsp12.Naproti tomu, pokud je nsp7-11 štěpen rekombinantním nsp5, aby se uvolnil nsp9 (a další nsp) z prekurzoru, je detekován radioaktivně značený protein, který migruje s nsp9, což potvrzuje náš závěr, že NiRAN a N-selektivní tvorba kovalentních nsp9-NMP aduktů .Terminální primární amin N-terminálního Asn (pozice 3825 v ppla/pp1ab).Tento závěr podporují také experimenty používající konstrukt nsp9, který obsahuje jeden nebo dva další zbytky na N-konci.V obou případech byla UMPylace nsp9 zprostředkovaná NiRAN zrušena (příloha SI, obrázek S7).Dále jsme vytvořili protein s jedním nebo dvěma zbytky Asn deletovanými z peptidové sekvence 3825-NNEIMPK-3832 na N-konci nsp9.V obou případech byla nsp9 UMPylace zcela blokována (obrázek 5B), což poskytuje další důkaz, že skutečný N-konec nsp9 působí jako NMP receptor.
Proteolytické zpracování nsp9 a role N-terminálních zbytků v nsp12-zprostředkované UMPylaci.(A) UMPylace nsp9 vyžaduje volný N-konec nsp9.Nsp7-11-His6 se preinkubuje při 30 °C v NMPylačním detekčním pufru obsahujícím UTP v přítomnosti nebo nepřítomnosti rekombinantního Mpro (nsp5-His6).Po 3 hodinách spusťte NMPylační test přidáním nsp12-His6, jak je popsáno v části Materiály a metody.Reakce obsahující nsp5-His6 (dráha 1) a nsp9-His6 (dráha 2) byla použita jako kontrola.Po 10 minutách byla reakce ukončena a reakční směs byla oddělena pomocí SDS-PAGE.Protein byl obarven Coomassie Brilliant Blue (A, nahoře).Prekurzor Nsp7-11-His6 a zpracovaný produkt, který je výsledkem štěpení zprostředkovaného nsp5-His6, jsou zobrazeny vpravo.Vezměte prosím na vědomí (kvůli jejich malé velikosti), že nsp7 a nsp11-His6 nejsou v tomto gelu detekovatelné a reakce je doplněna nsp5-His6 (dráhy 1 a 4; pozice nsp5-His6 je označena plným kroužkem) nebo nsp9-His6 (dráha 2) obsahuje malé množství MBP (označeno prázdnými kroužky) jako zbytkové nečistoty, protože jsou exprimovány jako fúzní proteiny MBP (příloha SI, tabulka S1).(B) Varianta Nsp9-His6 postrádá jeden nebo dva N-terminální Asn zbytky (číslování zbytků podle polohy v ppla/pp1ab) a je purifikována a inkubována s nsp12-His6 a [a-32P] UTP.B, SDS-PAGE obarvená Coomassie je zobrazena nahoře, B, odpovídající autoradiograf je zobrazen dole.Pozice markeru molekulové hmotnosti (v kilodaltonech) je uvedena vlevo.(C) HCoV-229E nsp9-His6 N-koncové konzervované zbytky byly nahrazeny Ala nebo Ser a stejné množství proteinu bylo použito v nsp12-His6 zprostředkované UMPylační reakci.Reakční produkty byly separovány pomocí SDS-PAGE a obarveny Coomassie Brilliant Blue (C, nahoře) a radioaktivně značený nsp9-His6 byl detekován fosforescenčním zobrazováním (C, uprostřed).S použitím proteinu divokého typu (wt) jako reference (nastaveno na 100 %) byla relativní aktivita NMPylace (průměr ± SEM) vypočtena ze tří nezávislých experimentů.(D) Titry viru v supernatantu pl buněčné kultury Huh-7 buněk infikovaných HCoV-229E divokého typu Huh-7 buněk a mutanty nesoucí označené aminokyselinové substituce v nsp9 byly stanoveny plakovým testem.Replikačně deficitní RdRp motiv C dvojitá mutanta DD4823/4AA byla použita jako negativní kontrola.
N-konec nsp9 (zejména pozice 1, 2, 3 a 6) je mezi členy podčeledi Orthocoronavirinae velmi konzervovaný (příloha SI, obrázek S6).Za účelem studia možné úlohy těchto zbytků v nsp9 NMPylaci zprostředkované nsp12 byly dva po sobě jdoucí zbytky Asn na N-konci nsp9 nahrazeny Ala nebo Ser (samotnými nebo v kombinaci).Ve srovnání s nsp9 divokého typu vedlo nahrazení N3825 Ala nebo Ser k více než dvojnásobnému snížení UMPylace zprostředkované nsp12 (obrázek 5C).V souladu s naším závěrem, že NMPylace se vyskytuje na N-terminálním primárním aminu namísto postranního řetězce N-terminálního zbytku, jsme pozorovali významnou zbytkovou NMPylaci s nahrazením N3825A a N3825S.Je zajímavé, že pokud je druhý Asn nahrazen Ala nebo Ser, nsp9 UMPylace se sníží silněji (více než 10krát), zatímco nahrazení Ala na pozicích 3, 4 a 6 má pouze mírný účinek na nsp9 UMPylaci (obrázek 2 ).5C).Podobné výsledky byly získány s použitím ATP, CTP nebo GTP (příloha SI, obrázek S8).Souhrnně tato data naznačují klíčovou roli N2826 (pozice 2 v nsp9) v nsp9 NMPylaci.
Abychom získali další důkaz o funkční korelaci mezi N-koncem nsp9 a NMPylací, provedli jsme vícenásobné zarovnání sekvencí (MSA) sekvence nsp9 z rodiny koronavirů (kolísající mezi 104 a 113 zbytky) (příloha SI, obrázek S6).Celkem bylo u 47 (známých a domnělých) druhů 5 rodů podčeledi Orthocoronavirinae, které infikují různé hostitele savce, ptáky a plazy, zjištěno celkem pouze 8 zbytků jako invariantních.Nejrozsáhlejší změny, včetně delecí a inzercí, byly pozorovány v cyklech mezi elementy sekundární struktury nsp9, jak bylo stanoveno předchozími strukturálními studiemi (26 -28).V β vláknu a α helixu C-terminální části nsp9 bylo nalezeno pět invariantních zbytků.Tři invariantní zbytky tvoří NNE motiv N konce nsp9.Ukázalo se, že druhý Asn tohoto motivu je jediným invariantním zbytkem, který je také sdílen hypotetickým nsp9 vzdáleně příbuzného žabího koronaviru a představuje druh Microhyla letovirus 1 v podčeledi Letovirinae of Alphaletovirus.Zachování zbytků v sekundárních strukturních prvcích nsp9 může být racionalizováno strukturálními úvahami, aby se zachovaly vlastnosti skládání nebo známých vazebných vlastností RNA.Zdá se však, že tato úvaha neplatí pro zachování NNE a před touto studií byla povaha omezení, která omezují variaci tripeptidové sekvence, zcela zatemněna.
Abychom určili důležitost nsp9-NMPylace a konzervace NNE v replikaci koronaviru, vytvořili jsme mutanty HCoV-229E, které nesou jednoduché nebo dvojité substituce nsp9 N-terminálních zbytků, což naznačuje, že nsp9 NMPylace je škodlivá in vitro.Než začneme, pokusíme se odpovědět na otázku, zda tyto substituce (v blízkosti místa štěpení nsp8|9) ovlivňují proteolytické zpracování C-terminální oblasti pp1a.Sada nsp7-11 polyproteinových konstruktů obsahujících odpovídající substituce na N-konci nsp9 byla produkována v E. coli a štěpena rekombinantním Mpro.Proteolytické štěpení čtyř míst (včetně přilehlého místa nsp9) není významně ovlivněno žádnými zavedenými substitucemi (příloha SI, obrázek S9), s výjimkou strukturálních změn v těchto proteinech, které interferují se štěpením nsp8|9 zprostředkovaným Mpro (nebo jiným) webová stránka.
Buňky Huh-7 byly transfekovány HCoV-229E RNA genomové délky, kódující substituce Ala nebo Ser v konzervovaných NNE tripeptidech (N3825, N3826 a E3827) na N-konci nsp9, což ukazuje, že většina mutací je fatálních.Podařilo se nám zachránit virus nahrazením Ser nebo Ala N-terminálního Asn (N2835A nebo N2835S), ale nepodařilo se nám obnovit virus jinými jednoduchými a dvojitými mutacemi v sekvenci NNE (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS), E3827A) (obrázek 5D).
Tyto výsledky naznačují, že replikace koronavirů v tkáňové kultuře je omezená (stejná nebo podobná), což omezuje přirozenou mutaci míst NMPylace nsp9 v těle a podporuje klíčovou roli této reakce v životním cyklu koronavirů.
V poslední sadě experimentů jsme produkovali C-koncový His6 značený SARS-CoV-2 nsp12 a nsp9 a dvě mutantní formy nsp12 v E. coli.Zbytky aktivního místa v doménách NiRAN a RdRp byly v tomto pořadí místo toho použijte Ala (obrázek 6A a příloha SI, tabulka S2).K4465 v SARS-CoV-2 nsp12 odpovídá K4135 v HCoV-229E (příloha SI, obrázek S2), která se ukázala jako nezbytná pro aktivitu NiRAN a replikaci HCoV-229E (obrázek 3D a E).Tento zbytek také odpovídá zbytku arteriálního viru EAV nsp9 K94, o kterém se dříve ukázalo, že je nezbytný pro NiRAN auto-UMPylaci/samo-GMPylaci (16).Jak je znázorněno na obrázku 6B, SARS-CoV-2 nsp12 má aktivitu UMP transferázy s použitím nsp9 jako substrátu, zatímco mutant aktivního místa nsp12_K4465A je neaktivní.Dvojitá substituce v SDD charakteristické sekvenci RdRp motivu C neovlivňuje aktivitu UMP transferázy (obrázek 6B), což ukazuje, že aktivita RdRp nemá žádný přímý účinek na nsp9 UMPylaci.Podobná data byla získána pomocí CTP, GTP a ATP (příloha SI, obrázek S10).V souhrnu tato data naznačují, že NMPylace nsp9 zprostředkovaná NiRAN má konzervativní aktivitu u koronavirů reprezentujících různé rody podrodiny ortokoronavirů.
SARS-CoV-2 nsp12-zprostředkovaná NMPylace nsp9.(A) Coomassie obarvený SDS-polyakrylamidový gel ukazující rekombinantní protein použitý v NMPylačním testu.Jako kontrola byl použit mutantní protein se substitucí aktivního místa v doméně NiRAN (K4465A) a doméně RdRp (DD5152/3AA) SARS-CoV-2 nsp12.Číslování zbytků je založeno na pozici v pp1ab.(B) Autoradiograf detekce UMPylace s použitím nsp9-His6 a [a-32P]UTP jako substrátu nsp12-His6 (divoký typ [wt] a mutant).Molekulová hmotnost (v kilodaltonech) značeného proteinu je uvedena vlevo.
Domény NiRAN jsou u Nidovirales obecně konzervované (16), což ukazuje, že katalyzují enzymatické reakce nezbytné pro replikaci nidovirů.V této studii jsme byli schopni prokázat, že doména NiRAN koronaviru přenáší NMP (vytvořený z NTP) na nsp9, záhadný protein vázající RNA zapojený do replikace viru (26 × 29 ), abychom jej určili jako přirozený cíl a partner koronavirové RTC.
Doména NiRAN sdílí tři sekvenční motivy (AN, BN a CN), které obsahují velmi malý počet zbytků, které jsou konzervované ve všech rodinách v monofyletickém, ale vysoce diferencovaném řádu Nidovirales (8, 16).Nedávné studie ukázaly, že jsou strukturálně příbuzné do značné míry necharakterizované rodině proteinů podobných proteinkináze, které se původně nazývaly rodina SelO (17, 19, 22, 30, 31).SelO-příbuzné proteiny mají kinázové záhyby, ale postrádají několik konzervovaných zbytků aktivního místa v klasických kinázách (22, 32).Na základě reverzní orientace molekul ATP navázaných na aktivní místo a stabilizovaných specifickými interakcemi byla vyslovena hypotéza a následně potvrzeno, že SelO přenáší AMP (místo fosfátu) do proteinového substrátu (22), zatímco jiný bakteriální protein podobný SelO YdiU má nedávno se ukázalo, že katalyzují kovalentní připojení UMP na zbytky Tyr a His různých proteinových substrátů (33).
Abychom potvrdili a rozšířili předpověď domnělých zbytků aktivního místa koronavirové domény NiRAN, použili jsme biochemické a reverzní genetické metody k provedení mutační analýzy na koronaviru nsp12 (obrázek 3D a příloha E a SI, obrázek S3 a tabulka) S1â S4).Data ukazují, že nahrazení HCoV-229E K4135, R4178 a D4280 Ala eliminuje in vitro aktivitu NMP transferázy a replikaci viru v buněčné kultuře (obrázek 3D a přílohy E a SI, obrázek S3), což podporuje jejich přítomnost v NTP γ-fosfátu (K4135, R4178) a koordinaci aktivních míst kovových iontů (D4280).Bylo ukázáno, že E4145A substituce konzervovaného Glu v rozsahu viru ptačího hnízda, o kterém se předpokládá, že stabilizuje polohu K4135 (17), eliminuje virovou replikaci, ale překvapivě byla aktivita zachována v in vitro NMPylačním testu (obrázek 3D a E a SI příloha, obrázek S3 a tabulky S1–S4).Podobné pozorování bylo učiněno, když byla odpovídající substituce zavedena do YdiU homologu Salmonella typhimurium (E130A) (33).Celkově vzato tato data podporují spíše regulační funkci tohoto konzervovaného zbytku než katalytickou funkci.
Nahrazení konzervovaného zbytku Phe (F4281A) v rozsahu nestoviru v doméně HCoV-229E NiRAN (8) mělo za následek snížení NMPylační aktivity in vitro a významné snížení replikace viru v buněčné kultuře (obrázek 3D, E a SI) příloha, obrázek S3).Data jsou v souladu s důležitou regulační funkcí tohoto zbytku, jako je homologní DFG motiv Phe zbytek ukázaný dříve.V klasických proteinkinázách je součástí Mg2+ vazebné smyčky a pomáhá sestavit a regulovat páteř???Nezbytné pro účinnou katalytickou aktivitu (32, 34).Nahrazení Ala a Arg za zbytky K4116 (v motivu preAN), v tomto pořadí, eliminovalo replikaci viru a podle očekávání mělo různé účinky na aktivitu NMP transferázy in vitro v závislosti na zavedeném postranním řetězci aminokyselin (obrázek 3D a přílohy E a SI , Obrázek S3).Funkční data jsou v souladu se strukturními informacemi, což naznačuje, že tento zbytek vytvořil interakci s ATP fosfátem (17).V doméně NiRAN jiných vnořených virových rodin je pozice HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 obsazena Lys, Arg nebo His (8), což ukazuje, že funkční omezení tohoto specifického zbytku bylo uvolněno.Substituce D4188A a D4283A eliminuje nebo silně snižuje aktivitu enzymu a eliminuje replikaci viru (obrázek 3).Tyto dva zbytky jsou konzervované ve většině (ale ne ve všech) vnořených virech (8), což ukazuje na důležitou rodinně specifickou, ale možná nekatalytickou funkci.Ala substituce několika dalších zbytků Lys a Asp (K4113A, D4180A, D4197A a D4273A), které nejsou konzervované u Coronaviridae nebo jiných čeledí Nestioviridae (8), byly použity jako kontroly.Jak se očekávalo, tyto substituce jsou do značné míry tolerovatelné, v některých případech s mírným poklesem aktivity enzymu a virové replikace (obrázek 3 a příloha SI, obrázek S3).Celkově jsou údaje o mutagenezi koronaviru velmi konzistentní s vlastními GMP a reverzními genetickými údaji EAV NiRAN-RdRp (16), ve kterých má EAV nsp9 (koronavirový nsp12 ortolog) zbytek K94 (odpovídající HCoV-229E K4135) důležité funkce), R124 (odpovídající R4178), D132 (odpovídající D4188), D165 (odpovídající D4280), F166 (odpovídající F4281).Kromě toho jsou údaje o mutagenezi HCoV-229E konzistentní a rozšířené z dříve hlášených reverzních genetických údajů SARS-CoV (16), stejně jako velmi podobné těm, které byly pozorovány pro odpovídající motiv CN Phe-to-Ala mutant SARS-CoV_nsp12. popsaný fenotyp -F219A a HCoV-229E_F4281A (obrázek 3 D a E a příloha SI, obrázek S3 a tabulka S1-S4).
Ve srovnání s EAV orthology (16), které jednoznačně preferují UTP a GTP (v auto-NMPylační reakci), naše studie ukazuje, že koronavirová doména NiRAN (reprezentovaná HCoV-229E a SARS-CoV-2) může být efektivně převedeny Všechny čtyři NMP, i když existuje mírná preference pro UMP (obrázky 1 a 3).Relativně nízká specificita specifického ko-substrátu NTP je v souladu s nedávno publikovanou superkompozitní strukturou SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13, ve které se ADP-Mg2+ váže na aktivní místo NiRAN, ale ne na adeninovou část. vzniku specifických interakcí (17).V naší studii nemá typ nukleotidu použitý v NMPylační reakci žádný rozdílný vliv na aktivitu mutantního proteinu (příloha SI, obrázek S3), což naznačuje, že žádný z těchto zbytků úzce nesouvisí s vazbou specifické nukleobáze.Strukturní základ a potenciální biologický význam různých NTP ko-substrátových preferencí pozorovaných v NiRAN doménách koronavirů a arteriálních virů zbývá prostudovat;mohou být pravdivé nebo mohou být způsobeny omezeními jejich příslušných studií.V současnosti nelze vyloučit, že potenciální NMPylátorová aktivita domény NiRAN arteriálního viru (ve srovnání s dříve charakterizovanou vlastní NMPylační aktivitou) má jinou kosubstrátovou preferenci, vezmeme-li v úvahu, že podobnost mezi arteriálním virem a koronavirem Doména NiRAN je na svém limitu.Porovnání založené na sekvencích (16).Ve srovnání s pseudokinázou SelO, která používá Mg2+ jako kofaktor, je aktivita koronaviru a arteriálního viru NiRAN závislá na Mn2+ (16) (obrázek 3C a příloha SI, obrázek S1).Závislost na Mn2+ a zřejmá preference UTP je neobvyklou vlastností proteinových NMPylátorů a byla teprve nedávno potvrzena u proteinu YdiU Salmonella typhimurium, který katalyzuje striktní Mn2+-dependentní proteinový chaperon UMPylaci k ochraně buněk před indukcí stresu Buněčný ATP pool ( 33).
Nedávno popsaná strukturální podobnost mezi doménou NiRAN koronaviru a buněčnými proteinkinázami (17, 19) poskytuje další podporu pro schopnost NiRAN kovalentně vázat NMP na jiné proteiny, které jsme uvedli v této studii.Naše hledání možných cílů NiRAN jsme zaměřili na proteiny kódované HCoV-229E ORF1a, o kterých je známo, že přímo nebo nepřímo pomáhají RTC replikáze kódované ORF1b (12, 35).Naše experimenty poskytují přesvědčivé důkazy pro účinnou a specifickou NMPylaci nsp9 (obrázek 2).Pokud je cílový protein použit v molárním přebytku, který je 8 až 10krát vyšší než molární přebytek enzymu (nsp12), je potvrzeno, že nsp9 je zcela (mono)NMPized (obrázek 4).Došli jsme k závěru, že interakce mezi nsp12 a nsp9 je krátkodobá a nevytvoří stabilní komplex s nsp9 (v nepřítomnosti jiných RTC podjednotek).Tento závěr podporují studie proteinových interakcí na proteomu SARS-CoV (35).MS analýza identifikovala primární amin N-koncového zbytku nsp9 jako místo NMPylace (příloha SI, obrázek S5).Tvorba fosforamidátové vazby a N-terminální aminoskupiny odlišuje NMPylační aktivitu zprostředkovanou NiRAN od AMPylační reakce zprostředkované SelO Pseudomonas syringae, která katalyzuje tvorbu O vázaného AMP na zbytcích Ser, Thr nebo Tyr Peptidový adukt ( 22) a S. typhimurium YdiU tvoří O-vázané (s Tyr) a N-vázané (s His) peptid-UMP adukty.Omezené informace dostupné o rodině proteinů SelO ukazují, že členové této velké rodiny proteinů se velmi liší ve vytváření aduktů peptid-NMP.To je zajímavý postřeh, který si zaslouží další studium.
Data získaná v této studii nás vedla k hypotéze, že NMPylace nsp9 vyžaduje volný N-konec.V kontextu virové replikace to bude zajištěno proteolytickým štěpením procesního místa nsp8|nsp9 v replikázovém polyproteinu pp1a zprostředkovaném Mpro a pp1ab.U většiny koronavirů je rozdíl mezi tímto specifickým místem (VKLQ|NNEI v HCoV-229E) a všemi ostatními místy štěpení koronaviru Mpro Asn (spíše než další malý zbytek, jako je Ala, Ser nebo Gly), který zabírá P1â???Místo (36).Údaje o štěpení peptidů získané v prvních studiích ukázaly, že účinnost štěpení místa nsp8|nsp9 byla nižší než účinnost jiných míst, což naznačuje, že 1) toto specifické místo může mít regulační roli ve včasném koordinovaném zpracování C-konce oblast pp1a nebo 2) a Role speciálního konzervovaného N-konce nsp9 při replikaci viru (37).Naše data (obrázek 5A) ukázala, že rekombinantní forma nsp9 nesoucí skutečnou N-koncovou sekvenci byla účinně NMP nsp12.N-terminální lemující sekvence byla odstraněna faktorem Xa (nsp9-His6; SI příloha, tabulka SI) nebo Mpro-zprostředkovaným štěpením (nsp7-11-His6; obrázek 5A a SI příloha, tabulka SI).Důležité je, že neštěpený prekurzor nsp7-11-His6 obsahující nsp9 vykazoval rezistenci vůči NMPylaci nsp12, což je v souladu s našimi údaji, což naznačuje, že adukt nsp9-NMP se tvoří prostřednictvím N-terminálního primárního aminu (příloha SI, obrázek S5) .Abychom získali hlubší porozumění substrátové specificitě NiRAN, zaměřili jsme se na sousední N-koncové zbytky nsp9.V nepřítomnosti jiných proteinů jsou strukturně flexibilní, což brání jejich detekci v neznačené formě nsp9 (26, 28, 38), což naznačuje jejich omezenou přirozenou variaci To je způsobeno důležitou sekvenčně specifickou (nesouvisející se sekundární strukturou) funkce N-koncového fragmentu nsp9.Ala substituce konzervovaných zbytků v této oblasti (obrázky 5C a D a SI příloha, obrázek S8) ukazují, že N3826 je nezbytný pro nsp9 NMPylaci in vitro, zatímco substituce N3825A a E3827A vedou ke snížení NMPylace, zatímco substituce M3829A a P3830A nikoli .Zjevně ovlivnit nsp9 NMPylaci.Ačkoli substituce N-koncového Asn (N3825A, N3825S) má pouze mírný účinek na nsp9 NMPylaci a replikaci viru v buněčné kultuře (obrázek 5C a D), delece sekvence zbytku Asn z N-koncového dipeptidu 3825-NN Ukázalo se, že je To je letální pro viry, což ukazuje, že je vyžadován jeden zbytek Asn před dalším zbytkem na N-konci, výhodně Asn, ačkoli se zdá, že substituce podobných zbytků může být částečně tolerována (obrázek 5B, C a D).Došli jsme k závěru, že dipeptid 3825-NN, zejména konzervovaný a esenciální zbytek N3826 v rozsahu koronaviru (příloha SI, obrázek S6), zajišťuje správnou vazbu a orientaci N-konce nsp9 v aktivním místě NiRAN.
Nahrazení Ala (E3827A) za konzervovaný Glu všech podrodin zachovává nsp9 NMPylaci in vitro, ale je letální pro viry v buněčné kultuře (obrázek 5C a D), což ukazuje na další funkci tohoto zbytku, například v klíčových interakcích (NMPylované nebo nemodifikované ) N-konec nsp9 a další faktory podílející se na replikaci viru.Mutace Nsp9 neovlivnily proteolytický proces nsp9 nebo jakéhokoli sousedního nsp (39) (příloha SI, obrázek S9), což naznačuje, že letální fenotypy několika pozorovaných mutací nsp9 nebyly způsobeny dysregulací oblasti C proteolytického procesu-terminální pp1a .
Výše uvedená data poskytují důkaz, že po Mpro-zprostředkované léčbě místa štěpení nsp8|9 v ppla/pp1ab může být N-konec nsp9 UMPylován (nebo částečně modifikován jiným NMP).Kromě toho nás vynikající konzervace N-konce nsp9 (včetně singulárních a invariantních zbytků Asn v rodině koronavirů) a data reverzní genetiky získaná v této studii (obrázky 3E a 5D) vedla k závěru, že popsaná NMPylace nsp9 je biologicky příbuzný a nezbytný pro replikaci koronaviru.Zbývá prostudovat funkční důsledky této modifikace, například pokud jde o dříve popsanou (nespecifickou) nsp9 (nemodifikovaná forma) vazebnou aktivitu RNA (2628).N-koncová NMPylace může také ovlivnit interakci nsp9 s proteinovými nebo RNA substráty nebo tvorbu různých čtyřúrovňových sestav.Ty byly pozorovány ve strukturálních studiích a bylo potvrzeno, že funkčně souvisejí s replikací koronaviru, i když zejména v nepřítomnosti V případě této modifikace (26- ââ29, 40).
Přestože je stále potřeba podrobněji charakterizovat cílovou specificitu koronavirové NiRAN domény, naše data ukazují, že proteinová cílová specificita koronavirové NiRAN domény je velmi úzká.Ačkoli konzervace zbytků klíčových aktivních míst (8, 16) v doméně NiRAN všech rodin nidovirů silně podporuje aktivitu konzervovaného NMPylatoru těchto proteinů, identita zbytků kapsy vázající substrát této domény Konzervace a konzervace zbývá charakterizovat a mohou se lišit mezi různými rodinami účelů Nidovirales.Podobně je třeba ještě určit relevantní cíle jiných vnořených virů.Mohou to být vzdálené orthology nsp9 nebo jiných proteinů, protože sekvence mimo pět replikázových domén, které jsou obecně konzervované ve vnořených virech, jsou méně konzervované (8), včetně genomového pole mezi Mpro a NiRAN, mezi nimi je nsp9 umístěn v koronavirus.
Navíc v současné době nemůžeme vyloučit možnost, že doména NiRAN má další (včetně celulárních) cílů.V tomto případě stojí za zmínku, že bakteriální homology v tomto nově vznikajícím proteinu NMPylators (NMPylators) (30, 31) mají zřejmě „hlavní regulátory“?NMP moduluje různé buněčné proteiny, aby reguloval nebo eliminoval jejich následné aktivity, čímž hraje roli v různých biologických procesech, jako je buněčná stresová reakce a redoxní homeostáza (22, 33).
V této studii (obrázky 2 a 4 a příloha SI, obrázky S3 a S5) jsme byli schopni prokázat, že nsp12 přenesl část UMP (NMP) do jedné (konzervované) pozice v nsp9, zatímco jiné proteiny nebyly v nsp9 modifikovány. použité Za podmínek je podporována dobře definovaná (spíše než volná) substrátová specifita.V souladu s tím, ve srovnání s N-koncovou nsp9 NMPylací, je vlastní NMPylační aktivita nsp12 velmi nízká, její detekce vyžaduje delší dobu autoradiografické expozice a používá se 10násobné zvýšení koncentrace nsp12.Kromě toho naše analýza MS nedokázala poskytnout důkaz pro NMPylaci nsp12, což naznačuje, že vlastní NMPylace domény NiRAN je (v nejlepším případě) sekundární aktivitou.Je však třeba poznamenat, že jiné studie poskytly předběžný důkaz, že stav auto-AMPylace bakteriálního NMPylatoru může řídit jejich NMPylační aktivitu na jiných proteinových substrátech (22, 33).Proto je zapotřebí více výzkumu, aby se prozkoumaly možné funkční účinky samo-NMPylačních aktivit hlášených pro EAV nsp9 (16) a koronavirus nsp12 (tato studie), včetně navrhovaného chaperonového efektu na skládání C-terminální RdRp domény ( 16)).
Dříve bylo zvažováno několik hypotéz týkajících se možných downstream funkcí nidovirové domény NiRAN, včetně RNA ligázy, RNA-capped guanylát transferázy a aktivity proteinového primingu (16), ale žádná z nich není kompatibilní s dostupnými downstream funkcemi.Informace získané na následujících pozicích jsou přesně ve stejném čase bez dalších předpokladů.Data získaná v této studii jsou nejvíce konzistentní (ale nemohou prokázat), že doména NiRAN je zapojena do iniciace proteinem indukované syntézy RNA.Dříve se věřilo, že funkce domény NiRAN v 5??²-RNA capping nebo RNA ligační reakce nejsou těmito a podporou dalších dat ovlivněny.Proto se například předpokládá, že aktivní místo NiRAN zahrnuje konzervovaný Asp jako obecnou bázi (D252 v Pseudomonas syringae SelO; D4271 v HCoV-229E pp1ab; D208 v SARS-CoV-2 nsp12) (příloha SI, obrázek 2 ).S2) (17, 22, 33), zatímco katalýzu v ATP-dependentní RNA ligáze a RNA capping enzymu provádí kovalentní enzym-(lysyl-N)-NMP meziprodukt, který zahrnuje nezměněný zbytek Lys ( 41).Kromě toho pozoruhodná sekvenčně založená specifičnost koronavirového NiRAN pro konzervované proteinové cíle a uvolněná specifita pro ko-substráty NTP (preferuje UTP) stojí proti funkcím capping enzymu zprostředkovanému NiRAN nebo funkcím podobným RNA ligáze.
Je zřejmé, že je zapotřebí mnoho práce navíc k ověření a pokud se to prokáže, rozpracování možné úlohy nsp9-UMP (nsp9-NMP) v proteinem indukované syntéze RNA, což spojí několik zajímavých, ale (zatím) dříve publikovaných zpráv. .Izolovaná pozorování.Například bylo stanoveno, že konec negativního vlákna RNA koronaviru začíná oligo(U) vláknem (42, 43).Toto pozorování je v souladu s myšlenkou, že syntéza RNA s negativním řetězcem je zahájena vazbou UMPylované formy nsp9 na poly(A) ocas (spouštěče), který může být podporován jeho vazbou na RNA Aktivita a/nebo interakce s další RTC protein.Část UMP poskytovaná nsp9 pak může být použita jako „primer“ pro oligouridylaci zprostředkovanou nsp7/8/nsp12 pomocí 3??²-poly(A) konce v genomové RNA nebo jiné sekvenci obsahující oligo (A) slouží jako templát, podobný mechanismu zavedenému pro protein VPg pikornaviru (44).Co když je návrh „nenormativní“????Zahájení (proteinem indukované) syntézy negativního vlákna RNA poskytuje spojení s pozorováním, což naznačuje, že RNA s negativním řetězcem koronaviru má na svém konci UMP (místo UTP) (42), což je považováno za důkaz, že nukleová kyselina Dicer štěpí konec fosforylovaný neznámou endonukleázou specifickou pro uridin.Pokud se potvrdí, tato hydrolytická aktivita nukleové kyseliny může pomoci uvolnit oligomerní UMPylovanou formu nsp9 z 5² konce vznikajícího negativního vlákna.Možná role nsp9 při aktivaci proteinů je také v souladu s předchozími studiemi reverzní genetiky, které ukázaly, že nsp9 (a nsp8) kriticky a specificky interagují s konzervovaným cis-působícím RNA elementem poblíž 3 konce genomu koronaviru.45).Podle této zprávy lze nyní tato předchozí pozorování znovu prozkoumat a rozšířit dalším výzkumem.
Stručně řečeno, naše data určila specifickou aktivitu vlastní značky enzymu nested viru spojeného s RdRp na N-konci.V koronaviru se tato nově objevená aktivita UMPylátoru/NMPylátoru zprostředkovaná NiRAN používá k tomu, aby se spoléhala na Mn2+ a sousední Asn zbytky a způsobila tvorbu (nízkoenergetických) fosforamidátových vazeb s N-koncovým primárním aminem.Prostřednictvím Mpro-zprostředkovaného štěpení v místě štěpení nsp8|9 lze cíl nsp9 použít pro NMPylaci, což ukazuje na funkční spojení mezi proteázou a doménou NiRAN, která sahá až k RdRp.Zachování klíčových zbytků v aktivním místě nsp12 NiRAN a cíli nsp9 v kombinaci s daty získanými ze dvou koronavirů včetně SARS-CoV-2 poskytuje silný důkaz, že nsp9 NMPylace je koronavirus. Konzervativní vlastnosti jsou také klíčovým krokem při replikaci viru.Dostupné údaje nás vedou k závěru, že specifická role NMPylované formy nsp9 v proteinem indukované syntéze RNA je rozumným scénářem pro koronavirus a další vnořené viry a NiRAN se může také zaměřit na jiné neidentifikované proteiny.Regulujte virus.Hostitelská interakce.Pokud se potvrdí, zapojení proteinových primerů do syntézy virové RNA zvýší sekvenční afinitu domén Mpro/3CLpro a RdRp mezi dříve detekovanou superskupinou koronaviru a pikornaviru (9), které byly nyní sjednoceny v nedávno zavedených Pisonivirites ( 46) v kategorii.
Naše data také ukazují, že základní, selektivní a konzervativní enzymové aktivity identifikované v této studii mohou být použity jako cíle pro antivirová léčiva.Sloučeniny, které interferují s vazbou (a následnou modifikací) konzervovaného N-konce nsp9 v aktivním místě NiRAN, mohou být vyvinuty do účinných a všestranných antivirotik, vhodných pro léčbu zvířecích a lidských koronavirů z různých (pod)rodin infekcí , včetně SARS-CoV-2 a blízkovýchodního respiračního syndromu Coronavirus.
Kódující sekvence koronavirového proteinu produkovaného v této studii byla amplifikována pomocí RT-PCR s použitím RNA izolované z Huh-7 infikovaných HCoV-229E nebo Vero E6 infikovaných SARS-CoV-2 a vložena pomocí standardních klonovacích postupů.pMAL-c2 (New England Biological Laboratory) nebo pASK3-Ub-CHis6 (47) expresní vektor (příloha SI, tabulky SI a S2).Substituce jednotlivých kodonů byly zavedeny místně cílenou mutagenezí založenou na PCR (48).K produkci fúzního proteinu MBP byly buňky E. coli TB1 transformovány vhodným konstruktem plasmidu pMAL-c2 (příloha SI, tabulka SI).Fúzní protein byl purifikován amylózovou afinitní chromatografií a štěpen faktorem Xa.Následně byl C-koncový His6-značený protein purifikován Ni-imobilizovaným kovem afinitní chromatografie (Ni-IMAC), jak bylo popsáno dříve (49).K produkci ubikvitinového fúzního proteinu buňky E. coli TB1 použily vhodný konstrukt plasmidu pASK3-Ub-CHis6 (příloha SI, tabulky SI a S2) a plasmidovou DNA pCGI kódující ubiquitin-specifickou C-terminální hydrolázu 1 (Ubpl).Transformace (47).C-koncový His6-značený koronavirový protein byl purifikován, jak bylo popsáno dříve (50).
Vlastní NMPylační test HCoV-229E nsp12-His6 byl proveden tak, jak je popsáno v EAV nsp9 (16).Stručně řečeno, nsp12-His6 (0,5 uM) obsahuje 50 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonové kyseliny (HEPES)-KOH, pH 8,0, 5 mM dithiothreitol (DTT), 6 mM MnCl2, 25 uM pufr, inkubovat specifikovaný NTP a 0,17 uM odpovídal [a32-P]NTP (3 000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) při 30 °C po dobu 30 minut.Ve všech ostatních (standardních) testech NMPylace nsp9 NMPylace zprostředkované nsp12 jsou reakční podmínky upraveny následovně: nsp12-His6 (0,05 uM) a nsp9-His6 (4 uM) v přítomnosti 50 mM HEPES-KOH (pH 8,0 ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 uM indikovaný NTP a 0,17 uM odpovídající [a32-P]NTP.Po inkubaci po dobu 10 minut při 30 °C byl reakční vzorek smíchán se vzorkovým pufrem SDS-PAGE: 62,5 mM tris(hydroxymethyl)aminomethan HC1 (pH 6,8), 100 mM DTT, 2,5 % SDS, 10 % glycerol a 0,005 % bromfenol modrý.Protein byl denaturován zahříváním na 90 °C po dobu 5 minut a separován 12% SDS-PAGE.Gel je fixován a obarven roztokem Coomassie Brilliant Blue (40% methanol, 10% kyselina octová, 0,05% Coomassie Brilliant Blue R-250), odbarven a vystaven fosforeskujícímu zobrazovacímu stínítku po dobu 20 hodin (pro detekci nsp12 z NMPylace) nebo (maximálně) 2 hodiny (pro hodnocení nsp9 NMPylace).Ke skenování obrazovky byl použit zobrazovač Typhoon 9200 (GE Healthcare) a k analýze intenzity signálu byl použit ImageJ.
Pro MS analýzu bylo použito 1 uM nsp12-His6 a 10 uM nsp9 (bez hexahistidinové značky) v NMPylační analýze (příloha SI, tabulka SI) a byla použita zvýšená koncentrace 500 uM UTP a GTP.V závislosti na jejich koncentraci a očekávané kvalitě proteinu byl použit systém Waters ACQUITY H-Class HPLC vybavený kolonou MassPrep (Waters) k online odsolení 1 až 10 ul pufrovaných proteinových roztoků.Odsolený protein se eluuje do elektrosprejového iontového zdroje hmotnostního spektrometru Synapt G2Si (Waters) následujícím gradientem pufru A (voda/0,05% kyselina mravenčí) a pufru B (acetonitril/0,045% kyselina mravenčí) a teplota kolony je 60 °C a průtok 0,1 ml/min: eluce isokraticky 5 % A po dobu 2 minut, poté lineární gradient na 95 % B během 8 minut a udržování 95 % B po další 4 minuty.
Jsou detekovány kladné ionty s hmotnostním rozsahem 500 až 5000 m/z.Glu-fibrinopeptid B se měří každých 45 sekund pro automatickou korekci hmotnostního driftu.Použijte přístrojový software MassLynx s rozšířením MaxEnt1 k dekonvoluci průměrného spektra po odečtení základní linie a vyhlazení.
UMPylovaný HCoV-229E nsp9 byl štěpen přidáním modifikovaného trypsinu sekvenačního stupně (Serva) a inkubován přes noc při 37 °C.K odsolení a zakoncentrování peptidů byla použita kolona Chromabond C18WP (číslo dílu 730522; Macherey-Nagel).Nakonec byl peptid rozpuštěn ve 25 ul vody, která obsahovala 5 % acetonitrilu a 0,1 % kyseliny mravenčí.
Vzorky byly analyzovány MS za použití hmotnostního spektrometru Orbitrap Velos Pro (Thermo Scientific).Ultimátní nanoâ HPLC systém (Dionex), vybavený zákaznickým koncovým 50 cm?75 μm C18 RP kolona naplněná 2,4 μm magnetickými kuličkami (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) Připojte se k hmotnostnímu spektrometru online prostřednictvím zdroje nanosprejů Proxeon;vstříkněte 6 ul roztoku pro štěpení trypsinem do vnitřního průměru 300 um x??1 cm C18 PepMap prekoncentrační kolona (Thermo Scientific).Za použití vody/0,05% kyseliny mravenčí jako rozpouštědla byl vzorek automaticky zachycen a odsolován při průtoku 6 ul/min.
Následující gradienty voda/0,05 % kyselina mravenčí (rozpouštědlo A) a 80 % acetonitril/0,045 % kyselina mravenčí (rozpouštědlo B) byly použity k dosažení separace tryptických peptidů při průtokové rychlosti 300 nL/min: 4 % B pro 5 minut, poté 30 A lineární gradient na 45 % B během minut a lineární nárůst na 95 % rozpouštědla B během 5 minut.Připojte chromatografickou kolonu k nanoemitoru z nerezové oceli (Proxeon) a nastříkejte eluent přímo do vyhřívané kapiláry hmotnostního spektrometru pomocí potenciálu 2 300 V. Snímání průzkumu s rozlišením 60 000 v hmotnostním analyzátoru Orbitrap je spojeno s alespoň třemi datovými MS/MS skeny, dynamicky vyloučenými po dobu 30 sekund, pomocí lineární iontové pasti vyvolané disociace nebo disociace kolize s vyšší energií v kombinaci s detekcí orbitrap, rozlišení je 7500.
Čas odeslání: srpen-03-2021